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龍眼體細胞胚胎發生早期SDG基因家族的全基因組鑒定與表達分析

來源:核心期刊咨詢網位置:醫學論文時間:2019-12-19 10:3312

  摘 要 SET domain group(SDG)基因家族控制的組蛋白賴氨酸甲基化,是參與染色質功能調控和表觀遺傳調控基因表達的重要部分。為了解龍眼(DlSDG)家族的生物學功能,采用生物信息學分析方法進行龍眼全基因組SDG家族成員的鑒定,并對蛋白質結構域、保守基序、基因結構、啟動子順勢作用元件、進化樹、相關基因的蛋白互作和體胚發生早期的基因表達情況進行預測和分析。結果顯示,龍眼SDG家族基因包括32個成員,分為Suv、Ash、ATXR5/ATXR6、Trx、E(z)、SMYD和SETD 7個亞家族,其中Suv亞族成員數量最多;外顯子數量在1~22個不等,蛋白結構域保守,都含有一個SET結構域,DlSDG蛋白保守motif不同亞家族間差異較大;DlSDG啟動子包含許多諸如低溫、干旱和壓力等非生物脅迫響應元件和激素響應元件;龍眼SDG成員在體胚發生早期均能不同程度表達,其中DlSUVR4b在EC和ICpEC階段可能發揮著較為重要的作用;DlSUVH4可以和DNA甲基轉移酶MET1發生互作。本研究表明,龍眼DlSDG 32個組蛋白賴氨酸甲基轉移酶基因可能除了在生物鐘的調節、植物發枝數量、根的生長發育、種子的萌發、花的發育和植株的形態建成等方面發揮重要功能外,也可能直接參與脅迫響應和體細胞胚胎發生的調控,并且還可能在參與DNA甲基化、染色質重塑的過程中形成體細胞胚胎發生的協作調控網絡,表現其具有功能上的多樣性、復雜性。

  關鍵詞 龍眼;組蛋白賴氨酸甲基轉移酶;成員鑒定;功能分析;表觀遺傳

大中醫學

  推薦閱讀:《大眾醫學》是中國辦刊歷史最悠久的醫學科普雜志,1948年8月創刊于上海。由上海科學技術出版社出版發行,同時在臺灣,新加坡發行相應臺灣版,新加坡版。并與中國盲文書社共同發行盲文版。

  在植物表觀遺傳學快速的發展背景下,植物組蛋白修飾作為重要的表觀遺傳調控手段已日益成為研究的熱點。組蛋白修飾同DNA甲基化、染色質重塑和非編碼RNA調控一樣是表觀遺傳調控的重要機制之一。真核生物中基因組DNA和組蛋白組裝在一起形成染色體。首先,組蛋白H2A、H2B形成二聚體,H3、H4形成四聚體,而染色質的核心組成單位八聚體由2個H2A、H2B二聚體和1個H3、H4四聚體組成,經146 bp的DNA纏繞形成染色體的基本組成單元核小體[1-3]。作為調控核小體結構的主要方式,組蛋白翻譯后修飾主要包括甲酰化(Formylation)、乙酰化(Acetylation)、甲基化(Methylation)、磷酸化(Phosphorylation)、泛素化(Ubiquity lation)、抑制基因表達的SUMO(small ubiquitin-like modifier modification,SUMOylation)化、ADP(ADP-ribosylation)核糖基化等修飾方式[4-7],且多發生在N端,多種組蛋白修飾結合與排列在一起構成了組蛋白密碼[8],組蛋白與組蛋白、組蛋白與DNA的互作受到組蛋白密碼的影響從而調控基因的轉錄與表達[9]。組蛋白甲基化修飾是最為復雜的植物組蛋白修飾方式,表現出修飾位點多樣性和不同程度的修飾。

  植物組蛋白賴氨酸甲基化共價修飾主要依賴賴氨酸甲基轉移酶來完成,含有SET結構域的SDG(SET domain group)是植物中唯一存在的具有組蛋白甲基轉移酶活性的蛋白家族。賴氨酸甲基轉移酶(histone lysine mathylatransferases,HKMTs)是兩類組蛋白甲基轉移酶的一大類,在植物中共發現17個組蛋白賴氨酸甲基化位點和7個精氨酸甲基化位點。組蛋白甲基化常發生在組蛋白H3、H4的賴氨酸(K)和精氨酸(R)的殘基上,賴氨酸殘基上發生最為常見。

  組蛋白賴氨酸甲基化修飾主要通過改變賴氨酸殘基甲基化狀態和程度,介導轉錄沉默與染色質的活化而不改變修飾位點攜帶的電荷量,從而提高組蛋白疏水性,改變組蛋白分子內部和分子間的相互作用,也可通過含有識別甲基化信號特定結構域的閱讀器來實現[10]。組蛋白賴氨酸甲基化可以發生單甲基化、雙甲基化和三甲基化3種不同程度的甲基化形式,其甲基化程度可以通過賴氨酸甲基轉移酶和賴氨酸去甲基轉移酶調控維持動態平衡[10]。H3和H4組蛋白中分別有5個(K4、K9、K27、K36、K79)賴氨酸殘基和1個(K20)賴氨酸殘基可被甲基化。一般H3K4、H3K36和H3K79甲基化通常和參與基因轉錄的激活有關,H3K9、H3K27和H4K20甲基化則和參與基因的轉錄抑制相關[11]。

  組蛋白賴氨酸甲基轉移酶在植物的生長發育中發揮著重要作用。組蛋白賴氨酸甲基化可以通過調控春化途徑從而參與開花、促進花粉發育的過程[12-13];還可以參與啟動植物種子萌發、調節根的生長發育、調節生物鐘以及與擬南芥的發枝數量等[14-17]。組蛋白賴氨酸甲基化能夠介導植物體細胞胚胎發生相關基因的表達,從而參與對體細胞胚胎生長發育過程的調控,并且植株的形態建成等完整生命過程均有組蛋白甲基化修飾的參與[18]。此外,組蛋白賴氨酸甲基轉移酶常通過調控基因的表達而參與各種脅迫應答反應。綜上,提示組蛋白賴氨酸甲基化幾乎參與了植物生長發育的所有過程。

  龍眼(Dimocarpus longan Lour.)是我國重要的熱帶、亞熱帶常綠木本果樹,果實富含蛋白質、氨基酸、類黃酮和多酚多種物質,營養價值和藥用價值極高[19],其胚胎發育情況很大程度上影響果實產量、品質和可食用率,但在龍眼生長發育的過程中仍然存在核大、可食率低的問題。賴鐘雄等[20-21]以龍眼幼胚為材料建立了龍眼松散型胚性愈傷組織系,進行長期保持,并以此為基礎開展了大量與龍眼體細胞胚胎發生相關的研究。但在龍眼體細胞胚胎發生的進程中關于組蛋白賴氨酸甲基轉移酶的研究未見報道。

  據其他植物研究報道,組蛋白賴氨酸甲基轉移酶基因MEA在胚胎和胚乳中表達,并通過基因組印跡參與胚胎和胚乳的發育[22-23]。因此,鑒于SDG在高等植物尤其是木本果樹胚胎發育過程中潛在的生物學功能,進一步的分析鑒定很有必要。在本實驗室龍眼基因組破譯的基礎上,基于基因組開展龍眼體胚發生早期組蛋白賴氨酸甲基轉移酶基因家族的生物學功能研究,不僅對龍眼生物技術的發展具有極大的意義,也對無患子科甚至所有木本植物體胚發生過程中組蛋白甲基轉移酶的研究具有重要借鑒意義。

  1 材料與方法

  1.1 材料

  采用本實驗室最新精確組裝的龍眼基因組及全轉錄組數據庫(待發表)進行分析。擬南芥(Arabidopsis thaliana)、甜橙(Citrus sinensis)基因序列、氨基酸序列下載于https://phytozome. html;水稻(Oryza sativa)氨基酸序列下載于Rice Annotation project Database(RAP-DB)[24]。

  1.2 方法

  1.2.1 龍眼DlSDG基因家族成員鑒定 為對龍眼DlSDG家族進行鑒定,首先選取模式植物擬南芥SDG氨基酸序列,經龍眼數據庫同源比對,結合NCBI Blast分析,初步篩選確定37條具有完整開放閱讀框的龍眼DlSDG候選序列。采用DNAMAN 6.0進行gDNA、CDS、氨基酸序列比對,其中Dlo032596、Dlo027491注釋一樣,經DNAMAN同源比對,Dlo032596、Dlo027491的CDS序列Identity為52.51%,氨基酸為42.38%,視為2條基因,分別命名為SUVH4a、SUVH4b;Dlo020952、Dlo020987的氨基酸同源比對顯示Identity為97.43%,CDS為97.96%,且5?端完全重合,選取Dlo020952進行后續分析;Dlo014820、Dlo034485的氨基酸和CDS同源比對顯示Identity均為100%,后續選取Dlo014820進行分析。結合SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)和Pfam結構域預測分析和Softberry基因全長預測分析,最終確定了龍眼基因組中存在32條DlSDG序列。

  1.2.2 龍眼DlSDG基因染色體定位與進化樹構建 根據擬南芥SDG成員在龍眼基因組中的查找注釋,參考擬南芥的命名方法對龍眼DlSDG基因家族成員進行命名。采用MEGA7的ClustalW對32個DlSDG基因家族成員氨基酸序列進行多序列比對分析,用進化樹構建軟件的Neighbor- joining method臨近法對龍眼、擬南芥、水稻、甜橙4個物種140條SDG基因家族成員的氨基酸序列進行系統進化樹構建,Bootstrap值設置為1000。采用TBtools[25]進行龍眼SDG基因染色體位置示意圖繪制。

  1.2.3 龍眼DlSDG基因結構及蛋白結構域分析 采用TBtools[25]軟件,利用龍眼gff文件和genome文件對龍眼DlSDG家族32個成員進行基因結構預測和分析;采用ExPASy對32條DlSDG氨基酸序列進行蛋白的等電點(pI)、分子量(Mw)、氨基酸數目等數據的分析;通過MEME(multiple expectation maximization for motif elicitafion)(http://meme-suite.org/tools/meme)進行龍眼DlSDG的保守基序分析,采用TBtools的可視化分析與motif圖片繪制。采用SMART和Pfam對龍眼DlSDG進行蛋白結構域在線預測,利用TBtools進行蛋白結構域示意圖繪制。

  1.2.4 龍眼DlSDG啟動子分析 采用TBtools進行龍眼DlSDG基因起始密碼子ATG上游2000 bp序列的提取。采用PlantCARE(http://bioinform a

  tics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網站在線預測分析龍眼DlSDG不同成員的啟動子特征和順勢作用元件功能特點,采用TBtools進行可視化繪圖。

  1.2.5 龍眼DlSDG成員蛋白互作預測分析 利用STRING(https://string-db.org)網站進行蛋白質互作預測、利用k均值聚類算法進行4個聚類分析,選用研究最深入的擬南芥作為參考,最低互動評分要求選擇highest confidence(0.900)探究DlSDG成員自身之間、與其他蛋白之間的互作情況。

  1.2.6 龍眼DlSDG家族體胚發生早期階段表達分析 為更深入的了解DlSDG在體細胞胚胎和不同組織器官中可能具有的功能特點,利用龍眼轉錄組數據庫提取DlSDG基因在不同體胚發生階段胚性愈傷組織(EC)、不完全胚性緊實結構(IcpEC)、球形胚(GE)特異表達的FPKM值,分析家族各成員的表達情況。利用TBtools繪制表達熱圖。

  2 結果與分析

  2.1 龍眼DlSDG家族基因鑒定與蛋白特性分析

  在龍眼中獲得了32個SDG家族成員。通過NCBI Blast雙向比對,與模式植物擬南芥、單子葉子植物水稻和木本果樹甜橙家族成員進行系統進化分析,將其命名情況見表1。SDG家族蛋白特性分析發現,該基因家族氨基酸長度相差較大,有336~2426 aa,大部分在1000 aa以下,蛋白分子量在36.33~275.37 ku之間,等電點(pI)為4.82~9.05(表1)。

  2.2 龍眼DlSDG家族基因染色體定位分析

  DlSDG家族基因染色體定位預測發現,賴氨酸甲基轉移酶家族基因成員能精確定位在組裝好的染色體上,在龍眼基因組組裝好的15條染色體中,染色體3、10、12沒有DlSDG成員分布(圖1)。DlSDG基因在染色體上分布不均勻,其中1、5、6、7、9、13、15號染色體均分布3個以上的賴氨酸甲基轉移酶家族成員,以6號染色體最多,存在6個成員的分布,4、11、14號染色體最少,均只有1個成員分布。為分析DlSDG基因家族成員數量的龐大是否因為基因的串聯重復導致,參考Huang等[26]的方法進行串聯重復分析,結果表明DlSDG家族成員無串聯復制現象存在(表1)。

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